Когда попытка добиться беременности с помощью оплодотворения in vitro не удается, мы часто не можем объяснить причину этого. Эта статья обращается к вопросу несостоятельности имплантации и роли иммунной системы в достижении успешной беременности. Какие методы обследования могут помочь установить причину неудачи, и что мы делаем, если обнаруживаем нарушения? Выступление доктора Каролины Кулам (Carolyn B. Coulam), одного из ведущих специалистов в области иммунологии репродукции, на 8-й конференции по оплодотворению in vitro в 1995 г. было посвящено этой проблеме.
В течение почти 20 лет применяется и развивается оплодотворение in vitro (IVF) и перенос эмбриона (ET). Но несмотря на технологические успехи, ведущие к повышению частоты зачатий, частота наступления имплантации при подсадке зародышей заметно не улучшилась и остается между 10 и 15%. Поэтому именно наступление или ненаступление имплантации отличает успешный цикл IVF от безуспешного, и частота безуспешных циклов при IVF составляет 70-80%. Неудачная имплантация может быть следствием либо аномалий зародыша либо аномалий эндометрия. По некоторым оценкам, частота зародышей с аномалиями хромосомного набора, доступных для имплантации, составляет 30-80%. Если вероятность получения аномального зародыша в результате IVF составляет 60%, а в полость матки переносится 3 зародыша, вероятность того, что хотя бы один зародыш окажется с нормальным хромосомным набором составляет 78%. Но почему же тогда частота наступления беременности в результате IVF составляет 30%? Определенное значение в этом могут иметь аномалии эндометрия (слизистой оболочки матки). Низкая частота имплантации и наступления беременности после IVF стимулировала исследования, направленные на понимание механизмов имплантации в связи с рецептивностью эндометрия и взаимодействиями между зародышем и маткой. В следующих разделах сделан обзор результатов этих исследований и представлены клинические приложения диагностики и лечения нарушений имплантации.
Успешная имплантация требует наличия рецептивного эндометрия и нормальных взаимодействий между рецептивным эндометрием и зародышем.
Эндометрий состоит из железистого эпителия, стромы и лимфомиелоидных клеток. Для поддержки нормальной беременности, эндометрий должен дифференцироваться в децидуальную оболочку. У человека эндометрий превращается в децидуальную оболочку под действием гормонов, лимфоидных и трофобластных клеток. Любые события, которые могут повлиять на действие гормонов, лимфоидных или трофобластных клеток могут затормозить нормальное развитие децидуальной оболочки. Факторы, которые могут помешать децидуальной функции можно разделить на анатомические, гормональные и иммунные. К анатомическим дефектам, которым приписывается неблагоприятное влияние на децидуальную функцию, относятся полипы эндометрия, подслизистые узлы миомы и внутриматочные сращения. Вероятно, что дефекты Мюллеровых протоков (аномалии строения матки) не являются причиной выкидыша в первом триместре беременности. Гормональная недостаточность, связанная с выкидышем в первом триместре беременности, включает в себя недостаток прогестерона. В последние годы появились публикации, в которых рассматривается роль иммунной системы в успехе имплантации зародыша.
Во время имплантации клетки трофобласта обмениваются сигналами с клетками эндометрия и с лимфоидными клетками. Медиаторами этих сигналов являются цитокины и белки поверхности клеток. HLA-G, белок тканевой совместимости, экспрессируемый на поверхности клеток трофобласта, распознается лимфоцитами CD8+. Лимфоциты CD8+ секретируют цитокины, которые стимулируют рост и дифференцировку клеток трофобласта. По мере того как трофобластные клетки пролиферируют и проникают в эндометрий, они дифференцируются на внутренний слой цитотрофобласта и наружный слой синцитиотрофобласта. Все факторы, могущие помешать дифференцировке цитотрофобласта в синцитиотрофобласт, могут помешать нормальному развитию беременности. Было показано, что антифосфолипидные антитела (АФА) задерживают дифференцировку цитотрофобласта в синцитиотрофобласт, и их присутствие в сыворотке крови женщин связано с неблагоприятным исходом беременности.
Клетки трофобласта устойчивы к лизису цитотоксическими T-лимфоцитами и NK-клетками (естественными киллерами), но не резистентны к лизису активированными NK-клетками, или LAK-клетками (lymphocyte activated killer). Было показано, что целый ряд цитокинов подавляет активацию NK-клеток и их превращение LAK-клетки и предотвращает аборт у мышей. Этими цитокинами являются интерлейкин-3 (IL3), фактор, стимулирующий колониеобразование гранулоцитов и моноцитов (GM-CSF), фактор трансформации роста бета 2 (TGF-бета-2) и белок с молекулярной массой 34кДа, вырабатываемые клетками CD8+, имеющими рецепторы к прогестерону. Выработка этих цитокинов изучалась на местном уровне в области фетодецидуальной интерфазы, но есть данные, что имеется и системная активность данных факторов. На системном уровне данные факторы могут определяться в виде системных эмбриотоксинов с помощью теста на эмбриотоксичность. В крови можно определять и уровень NK-клеток (клеток CD56+). Повышение процента клеток CD56+ в крови был связано с ранним прерыванием кариотипически нормальной беременности. В связи с этим выявление повышенных концентраций в крови антифосфолипидов (а также других аутоантител, включая антитиреоидные и антиядерные антитела), повышенного процента клеток CD56+ и повышенного содержания эмбриотоксинов используется для выявление женщин, относящихся к группе риска наличия иммунологических факторов, способствующих неполноценной имплантации.
Понимание механизма развития неполноценной имплантации позволяет применить более целенаправленный подход к выявлению факторов риска данного состояния. В настоящее время для выявления факторов риска используются определение в крови антифосфолипидных антител, процента циркулирующих клеток CD56+ и выявление циркулирующих эмбриотоксинов.
Для выяснения активности антифосфолипидных антител была проведена большая работа. Молекулы фосфолипидов выполняют адгезивную функцию при формировании синцитиотрофобласта. Иммуногенное состояние возникает при экспозиции поверхностных фосфолипидов (особенно фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина в форме гексагональной фазы II). Антитела к этим фосфолипидам вмешиваются в процесс образования синцитиотрофобласта из цитотрофобласта, что ведет к задержке синцитиолизации цитотрофобласта. Данный механизм был предложен для объяснения патогенеза недостаточности имплантации. В настоящее время изучается роль других аутоантител в развитии неполноценной имплантации, включая антинуклеарные и антитиреоидные антитела.
Было показано, что моноциты децидуальной оболочки, которые имеют экспрессию CD56+, связаны с успехом имплантации. Дефицит естественных клеток-киллеров, имеющих фенотип CD56+, наблюдался в биоптатах из плацентарного ложа у женщин с угрожающим ранним выкидышем. Исследования на животных показали значение клеток CD56+ в предотвращении выкидыша через четыре дня после начала имплантации. В этой модели успех эмбрионального аллографта был связан с локальной суппрессии на уровне децидуальной оболочки факторами, выделяемыми клетками CD56+. В других исследованиях было высказано предположение, что для успеха репродуктивного процесса важна системная регуляция антитрофобластных клеток-киллеров. Было показано, что у женщин, страдающих привычным невынашиванием беременности, периферические NK-клетки участвуют в цитотоксических реакциях на трофобластные клетки собственных зародышей женщины.
Было показано, что концентрации циркулирующих клеток CD56+ коррелируют с успехом наступления беременности у бесплодных женщин. Процент циркулирующих клеток CD56+ больше 12 предсказывает отторжение кариотипически нормального зародыша со специфичностью 87% и с положительной предиктивной ценностью в 78%. Однако, хотя этот тест обладает высокой специфичностью, его чувствительность среди бесплодных женщин, которым проводится лечение вспомогательными методами репродукции, достаточно низка (54%), что указывает на то, что данное исследование не может выявить все периимплантационные потери среди данных супружеских пар (например, аномальные зародыши).
Целый ряд исследователей обнаружили эмбриотоксические факторы в крови женщин с репродуктивной недостаточностью. Было показано, что эти эмбриотоксины относятся как к высокомолекулярным (иммуноглобулины), так и к низкомолекулярным (цитокины) фракциям. В то время как в децидуальной ткани был выявлен широкий спектр растворимых медиаторов, способствующих имплантации, некоторые цитокины могут оказывать прямое или непрямое цитотоксическое действие на зародыш. Для выявления таких эмбриотоксинов был разработан специальный тест, использующий бластоцисты мыши. Этот тест прошел первые испытания и называется тестом на эмбриотоксичность.
Можно ожидать, что иммунотерапия может помочь повысить шансы рождения живого ребенка в случаях, когда иммунологические механизмы принимают участие генезе нарушения течения беременности. Однако иммунотерапия не может помочь в случаях, когда невынашивание связано с аномалиями зародыша. Это указывает на важность выявления именно тех пациенток, которым может помочь иммунотерапия. Понимание патогенетических механизмов нарушения имплантации позволяет применить сфокусированный подход к специфичности лечения. К тестам, которые могут быть использованы для выработки тактики лечения, относятся определение уровня антифосфолипидных антител, циркулирующих клеток CD56+ и циркулирующих эмбриотоксинов.
В недавнем исследовании Sher и сотр. сообщили, что АФА были обнаружены в крови 53% женщин с диагнозом органического заболевания таза, которым предполагалось проведение IVF. Назначение аспирина по 80 мг в день и гепарина по 5000 МЕ 2 раза в день значительно (p менее 0,05) улучшило частоту жизнеспособной беременности (49%) по сравнению с не леченной группой женщин с АФА (16%). Таким образом, у женщин с АФА, которым проводилось лечение методом IVF, было показано повышение частоты беременности на 33%.
Мы сравнили частоту положительного анализа на АФА у женщин с успешными и с безуспешными циклами IVF. Частота положительного анализа на АФА среди женщин с безуспешными циклами (26%) была значительно (p=0,007) выше, чем у женщин с успешными циклами (5%).
Недавние данные указывают, что лечение внутривенными иммуноглобулинами (IVIg) помогает удержать беременность у женщин с повышенным уровнем клеток CD56+ в крови. В данном исследовании 13 женщинам проводилось лечение IVIg и ни у одной из них не было выкидыша. Частота повышенных уровней циркулирующих клеток CD56+, связанных с исходом беременности у женщин, получавших и не получавших IVIg представлена в табл. 1. У женщин с уровнем CD56+ клеток выше 12%, частота благоприятного исхода беременности была значительно выше (p=0,0002) при назначении IVIg.
Эмбриотоксические факторы были выявлены в крови женщин с неудачными попытками IVF. Эти эмбриотоксические факторы могут вырабатываться активированными лимфоцитами после стимуляции трофобластом. Поскольку было показано, что лечение IVIg регулирует функцию как Т-, так и В-лимфоцитов, достаточно обосновано применение данного метода лечения у женщин с неполноценной имплантацией на фоне циркулирующих эмбриотоксинов. Лечение женщин с положительным тестом на эмбриотоксичность путем внутривенного введения иммуноглобулинов привело к рождению живых детей. Однако в этих исследованиях не было контрольных групп. Хотя резонно, что применение иммунотерапии, которая модулирует выработку цитокинов, должно быть эффективно для модулирования выработки цитокинов, проявляющих эмбриотоксическое действие, для уточнения эффективности иммунотерапии при привычном невынашивании беременности, связанном с циркулирующими эмбриотоксинами, требуются дальнейшие исследования.
После первых сообщений об успешной иммунотерапии постфертилизационной недостаточности (привычное невынашивание беременности), возник вопрос о возможности ее применения для лечения пре- и периимплантационной недостаточности. Постановка этого вопроса связана с наблюдением, что при имплантации важную роль играет воспалительная реакция. Факторы воспалительной реакции необходимы для успешной беременности. Некоторые из этих факторов имеются в плазме спермы. В исследованиях на животных было показано, что эти факторы потенцируют имплантацию. Но некоторые компоненты воспалительной реакции могут быть фатальны для беременности. Было показано, что некоторые заболевания, возникающие в результате воспалительных реакций, могут быть успешно лечены с помощью IVIg.
Сравнение частоты наступления беременности при применении инсеминации и при абстиненции в день переноса гамет у женщин, лечившихся от бесплодия с помощью IVF (53% против 23%) и GIFT (81% против 31%, p менее 0,01) показало благоприятное влияние инсеминации на исход лечения. В большом числе исследований на животных было показано, что это было связано не со сперматозоидами, а с фактором или с факторами плазмы спермы. Частота имплантации бластоцист у крысы на 4-й день псевдобеременности была значительно выше (91%) после инсеминации плазмы спермы, чем в контрольной группе (45%). В других исследованиях было показано, что частота имплантации у мышей, крыс и хомячков значительно снижается после хирургического удаления семенных пузырьков, но не после удаления вентральной части предстательной железы. Дальнейшие исследования на хомячках позволили предположить, что снижение процента имплантации после удаления семенных пузырьков является результатом более медленного деления клеток в процессе эмбрионального развития и гибелью зародышей. Удаление семенных пузырьков не влияло на частоту зачатий, а задержка делений наблюдалась через 72 часа после коитуса; имплантация происходила через 122 часа после коитуса.
В рандомизированном исследовании с использованием контрольной группы, в которой применялось плацебо, проводилось исследование влияния плазмы спермы на частоту имплантации. В исследовании участвовало 87 женщин, лечившихся по поводу бесплодия. 44 женщины получали влагалищные капсулы, содержащие плазму спермы, а 43 женщины получали плацебо на 7-й, 14-й и 21-й дни менструального цикла. У женщин, которые получали семенную плазму, ультразвуковое подтверждение имплантации наблюдалось чаще, чем у женщин, получавших плацебо (80% против 64%). Природа фактора или факторов плазмы спермы, потенцирующих имплантацию, пока не известна. Было показано, что имплантацию потенцируют такие факторы спермы, как полиамины, TGF-альфа и остеопонтин. После того как специфические усилители имплантации будут выделены из плазмы семени человека, они смогут быть использованы для лечения бесплодия, обусловленного постфертилизационной недостаточностью.
В нескольких исследованиях было показано повышение частоты имплантации по сравнению с применением плацебо у женщин, лечившихся по поводу бесплодия методом IVF, которым проводилось внутривенное введение иммуноглобулинов. Для ответа на вопрос о том, каким женщинам целесообразнее всего проводить лечение иммуноглобулинами было проведено исследование, в котором приняли участие женщины, у которых беременность не наступила после переноса в полость матки не менее 12 зародышей. Была выделена группа женщин, являвшихся эффективными производителями зародышей (более 50% оплодотворенных яйцеклеток и не менее 3-х зародышей, в каждом лечебном цикле). В данной группе беременность наступила у 56% пациенток. В группе неэффективных производителей частота наступления беременности составила всего лишь 5%. Частота имплантации составила 17% в группе эффективных производителей и 0% в группе неэффективных производителей (p=0,007). Частота живорождений на одну пациентку была существенно выше в группе эффективных производителей (44%), чем в группе неэффективных производителей (0%) (p=0,0002). Таким образом, вероятно, что усиление эффективности лечения бесплодия методом IVF с помощью IVIg наиболее вероятно у женщин, у которых в анамнезе был выкидыш кариотипически нормальным зародышем, выкидыши на доклинической стадии в анамнезе, у которых в процессе IVF оплодотворение наступает у более 50% яйцеклеток, и у которых в каждом цикле IVF образуется не менее трех зародышей.
