До недавнего времени о первой неделе развития зародыша человека было известно очень мало, так как находки оплодотворенных яиц в женских половых путях были случайны и чрезвычайно редки. Самая богатая коллекция гистологических препаратов зародышей человека ранних стадий развития принадлежи кафедре эмбриологии Института им. Карнеги в Вашингтоне. Она включает более 600 препаратов, явившихся предметом систематического обзора R.O’Rahilly (85). Классификация “Карнеги” в настоящее время принята во всем мире подавляющим большинством авторов, занимающихся ранними этапами развития человека:
| Стадия "Карнеги" | Длина | Возраст (дни) | Главные события |
|---|---|---|---|
| 1 | 1 | Оплодотворение | |
| 2 | 2 - 3 | 2 - 16 бластомеров | |
| 3 | 4 - 5 | Свободная бластоциста | |
| 4 | 5 - 6 | Начало нидации | |
| 5 | 0.1 - 0.2 | 7 - 12 | Нидация и изменение трофобласта |
(По 24)
Только многолетний труд Роберта Эдвардса позволил выработать методы выращивания зародышей человека до стадии бластоцисты in vitro и более углубленное изучение процессов раннего эмбриогенеза.
Оплодотворение происходит, как правило, в ампуле маточной трубы. Дробящийся зародышдвижется по трубе в полость матки. Важную роль в этом транспорте играют ампулярно-перешеечное соединение и перешеек, обладающие хорошо развитой мускулатурой и ресничками. Ампулярно-перешеечное соединение может быть местом нахождения водителя ритма трубы (34).
Движение зародыша, окруженного клетками яйценосного бугорка и лучистого венца, в ампуле сопровождается его неполным вращением. В месте маточно-трубного соединения уже была обнаружена сфинктерная активность. В маточной трубе женщины зародыш может находиться до четырех дней. 72 часа зародыши находятся в ампуле, включая время прохождения ампулярно-перешеечного соединения (30 часов), и затем быстро проходят через перешеек в полость матки.
Самая поздняя стадия развития зародыша человека среди всех зародышей, выделенных из маточной трубы, - семиклеточный зародыш, обнаруженный в проксимальной средней четверти трубы через 83 часа после полового сношения и через 77 часов после пика ЛГ. Он был свободен от клеток лучистого венца, немного уплощен, имел полярные тельца и содержал бластомеры неодинаковых размеров (4). Зародыши различных стадий были вымыты и из полости матки. Самый ранний из них - 12-тиклеточный, самый поздний 186-клеточная бластоциста (21,51). У большинства видов, в том числе у человека, зародыш обычно попадает в матку на 8-клеточной стадии. Согласно классификации "Карнеги" I стадия развития зародыша соответствует оплодотворению. Если за отправную точку отсчета времени принять момент встречи гамет (час 0), события быстро разворачиваются следующим образом: час 2 - диссоциация клеток яйценосного бугорка; час 7 - прохождение через прозрачную оболочку; между часом 12 и часом 24 - образование и слияние двух пронуклеусов. Общий диаметр зиготы с прозрачной оболочкой составляет в среднем 175 мкм. Диаметр собственно зиготы 100 мкм, диаметр каждого пронуклеуса 30 мкм.
Стадия 2 - дробление - начинается с окончанием первого митотического деления, т.е. с появлением двух бластомеров, между 24-м и 30-м часом. Она характеризуется серией делений в быстром ритме, примерно одно в каждые 24 часа, вплоть до появления полости дробления. В течение всей этой стадии форма и размеры зародыша не меняются, что обусловлено сохранением блестящей оболочки. При достижении 12-тиклеточной стадии зародыш становится морулой (появление центральной массы).
3-я стадия характеризуется превращением морулы в зародышевый пузырек, или бластоцисту, путем образования полости, бластоцеле.
После стадии 4-х-8-ми бластомеров зародыш претерпевает важные изменения, называемые компакцией. До стадии 4-8 бластомеров индивилуальные бластомеры отличаются друг от друга. Компакция характеризуется изменением структуры и свойств цитоплазматических мембран. Отдельные бластомеры становятся неотличимы друг от друга, и упаковка их становится очень компактной (отсюда и название процесса). Эти изменения в цитоструктуре совпадают со значительными изменениями в ультраструктуре цитоплазмы и цитоплазматических органелл. Компакция приводит к образованию наружного слоя клеток, будущей трофэктодермы. На этой стадии между бластомерами появляются плотные соединения, десмосомы.
Многие эмбриологи полагают, что клеточное движение в эту стадию определяет выделение стволовых клеток зародыша: наружные клетки дают начало трофэктодерме, а внутренние - внутренней клеточной массе бластоцисты. С этого времени свойства разных бластомеров становятся разными. Происходят модификации в структуре и свойствах трофэктодермы, включающие синтез поверхностных гликопротеинов, появление систем мембранного транспорта и изменения в метаболизме липидов клеточных мембран.
Морулы человека и одна бластоциста были вымыты из полости матки приблизительно через 5 дней после овуляции. Бластоциста была окружена прозрачной оболочкой, состояла из 180-ти клеток и имела строение, типичное для бластоцист других видов (22). В отличие от некоторых других видов (кролик, свинья), в преимплантационном периоде бластоциста человека не претерпевает значительного увеличения в размерах (экспансии). При выращивании бластоцист человека в культуре было установлено, что они обладают четко выраженной внутренней клеточной массой и большой полостью, возникающей после появления скопления больших клеток на одном полюсе морулы.
В трофобласте различают два типа клеток: типичные стеночные (муральные) клетки и другие клетки, имеющие признаки секреторной активности. Прозрачная оболочка сохраняется и окружает бластоцисту у многих видов. Она либо сбрасывается до или во время имплантации благодаря действию самого зародыша - процесс, названный "вылупливанием" (hatching) из наблюдений над зародышами грызунов, - либо растворяется под действием маточного секрета и ферментов зародыша. У некоторых видов бластоцисты ритмически сокращаются, пульсируют. У мыши при ритмических сокращениях большое количество жидкости изгоняется из бластоцеле в пространство между зародышем и прозрачной оболочкой. Подобную же пульсацию проявляли в культуре и отдельные бластоцисты человека.
Развитие зародыша контролируют некие внутренние часы. Характер этой регуляции пока не известен. Скорее всего, она не связана непосредственно с хронологическим возрастом и, по-видимому, определяется, в первую очередь, числом ядерных или цитоплазматических делений.
Ранние стадии развития зародышей млекопитающих в определенной степени резистентны к действию различных тератогенов (ионизирующая радиация, лекарственные препараты, алкоголь) (34). Это обусловлено, скорее всего, отсутствием в это время значительных клеточных миграций и сходными метаболическими потребностями бластомеров (34).
Отдельные бластомеры различимы до 8-клеточной стадии. Компакция начинается с 1б-клеточной стадии. По данным изучения развития зародышей человека в культуре хронология развития их может быть представлена следующей таблицей:
| Стадия | 1 | 2 |
|---|---|---|
| 2 бластомера | 34.9 ± 1.9 | 46 |
| 4 бластомера | 51.2 ± 1.9 | 63 |
| 8 бластомеров | 67.9 ± 2.5 | 86 |
| 16 бластомеров | 84.6 ± 3.4 | 112 |
| Морула | 100.2 ± 3.0 | 120 |
| Ранняя бластоциста | 112.7 ± 3.8 | 132 |
Время от оплодотворения до достижения стадии развития (часы)
1: расчетное среднее время стадии дробления ± стандартная ошибка;
2: Верхняя 95%-ная точка (время от оплодотворения, когда 95% зародышей достигают данной стадии) (34)
Для переноса зародышей в полость матки после оплодотворения вне организма наиболее пригодны 16-клеточные зародыши (34).
Жидкость бластоцеле частично изолирована от окружающей среды и образуется, вероятно, за счет активного транспорта таких ионов, как ионы натрия, хлора и бикарбоната, что сопровождается движением в бластоцеле воды и углекислого газа. Белки могут пересекать трофобласт и входить в бластоцеле, но механизмы этого транспорта еще требуют окончательного выяснения.
Дифференцировка зародыша млекопитающих сопровождается значительными изменениями его ультраструктуры, причем многие изменения цитоплазмы и органелл отражают растущую сложность обмена веществ зародыша. Некоторые цитоплазматические структуры унаследованы от яйцеклетки и представляют собой запасы РНК и белков матери, но они быстро исчезают во время дробления. В бластомерах имеется много вирусоподобных частиц, но об их значении для раннего развития можно только догадываться. В свойствах клеточной поверхности, особенно клеточной поверхности трофобласта, происходят локальные изменения, которые, должно быть, связаны со все более сложными функциями мембранного транспорта и ответа морулы и бластоцисты на внешние факторы.
Ультраструктура бластомеров тесно связана с изменениями их метаболизма в течение дробления. Исследование дробящихся зародышей с помощью трансмиссионной электронной микроскопии выяснило природу важных изменений в структуре цитоплазмы и органелл во время начальных стадий роста. Относительно простая структура бластомеров периода раннего дробления сменяется развитием эндоплазматической сети, появлением многочисленных рибосом и изменениями митохондрий. Эти изменения указывают на то, что у морул и бластоцист, или даже раньше, начался активный синтез белка. Типичные цистерны шероховатой эндоплазматической сети, скудные во время раннего дробления, становятся выраженными после 8-клеточной стадии. Они формируются вблизи наружной ядерной мембраны одновременно с уменьшением количества гладкой эндоплазматической сети. Видимо, эти изменения также связаны с усилением синтеза белка.
Характерные изменения были обнаружены и в других органеллах. Ядрышки из округлых образований с плотной волокнистой структурой в течение раннего развития становятся более вакуолизированными и зернистыми. Эти изменения совпадают с увеличением числа рибосом и полирибосом и связаны, по-видимому, с синтезом рРНК. В течение дробления значительные изменения демонстрируют и митохондрии. Их морфология постоянна до 4-клеточной стадии, а затем резко меняется. У одноклеточных зигот они маленькие, электронноплотные и сферические и имеют мало крист. В течение дробления митохондрии удлиняются, в них появляется большое количество пластинчатых крист, которые могут быть растянуты и вакуолизированы. Есть указания, что у некоторых видов в клетках трофобласта и внутренней клеточной массы могут быть разные кристы. Митохондрии являются источником АТФ, кругооборот которого в период дробления очень высок.
В течение преимплантационного периода развития в клетках зародыша были обнаружены различные включения. В оплодотворенных яйцеклетках некоторых видов, как то: мышь и крыса, были обнаружены решеткоподобные структуры, отсутствующие в зародышах человека и кролика. В клетках зародышей могут быть цепочки рибосом, унаследованные от матери и используемые для поддержания белкового синтеза в течение короткого периода времени после оплодотворения, пока зародыш не сможет приступить к синтезу собственных белков. В бластомерах ранних зародышей некоторых видов были обнаружены кристаллические образования, и, если они связаны с эндоплазматической сетью, что характерно для определенных видов, то число и размеры их увеличиваются после раннего дробления. Иногда такие образования достигают очень больших размеров, например, в трофобласте кролика, при этом сходные структуры имеются и в эндометрии. Не исключено, что это материнские белки, переходящие из эндометрия в зародыш.
В зародышах и в клетках репродуктивного тракта млекопитающих, также как и во многих других типах соматических клеток, были обнаружены вирусоподобные частицы. Эти частицы похожи на опухолевые РНК вирусы, так как диаметр их около 50-100 нм, и они окружены электронно-плотными капсулами. В соматических клетках они подразделяются на три типа: тип A обнаруживается в цитоплазме или в цистернах эндоплазматической сети; тип B очень напоминает тип A, но имеет несколько отличную структуру; тип C располагается экстрацеллюлярно, например, мышиный вирус типа C. Вирусы могут наследоваться от матери путем прямой передачи и при трубных или маточных инфекциях, и такая форма наследования обычно называется вертикальной передачей. Некоторые опухолевые РНК вирусы являются эндогенными, представлены в половых и соматических клетках и передаются генетически по менделевскому типу. Вирусы, передающиеся при инфекциях, колонизируют все зародыши и не проявляют сходного менделевского распределения.
Вирусоподобные частицы были обнаружены при электронной микроскопии в зародышах, выделенных из маточной трубы, и, очевидно, латентная вирусная инфекция раннего зародыша широко распространена у млекопитающих. Геном мыши содержит много связанных с вирусами генов, которые на определенных этапах развития могут дать начало вирусным частицам. В дробящихся зародышах мыши было обнаружено четыре морфологически различных типа частиц, три из которых напоминают известные опухолевые РНК-вирусы.
Частицы типа А в течение короткого времени представлены в яйцеклетке, исчезают при оплодотворении и вновь на короткое время появляются в дробящемся зародыше, а именно, во внеклеточном пространстве, в цистернах и эндоплазматической сети бластомеров после двуклеточной стадии. Их появление совпадает, вероятно, с синтезом рибосомной РНК зародышей. РНК-вирусы типа С были обнаружены в зародышах кролика и бабуина. Они, очевидно, отпочковываются от плазматических мембран зародыша. Кроме того, они были обнаружены в клетках плацентарных мембран человека. Зародыши могут быть искусственно инфицированы обезьяним вирусом 40, вирусом полиомы и вирусом ньюкастлской болезни, причем после заражения были обнаружены различные цитоплазматические эффекты и уменьшение процента имплантации. Некоторые вирусные белки иммуногистологически были обнаружены в яйцеклетках и в дробящихся зародышах, что говорит о том, что вирусы активно участвуют в репликации и делении. Однако существует некоторое несогласие в отношении того, являются ли ультраструктурные образы вирусоподобных частиц прямым указанием на инфекцию и репликацию вирусов в зародышевых клетках. ДНК-вирусы также могут участвовать в репродукции, например вирус герпеса типа 2.
Изменения в структуре поверхности зародышей были выявлены также и при сканирующей электронной микроскопии. Так, при овуляции уменьшаются микроворсинки и складки мембраны яйцеклеток. Конические отростки и короткие микроворсинки, имеющиеся у одноклеточного зародыша млекопитающих, увеличиваются в числе и размерах к двуклеточной стадии, а на четырехклеточной стадии на поверхности отдельных клеток появляются углубления. В ходе дальнейшего дробления углубления постепенно исчезают, зато микроворсинки становятся более многочисленными, и одновременно с этим плотность поверхности зародыша значительно увеличивается, особенно на стадии бластоцисты, за счет образования тонких складок мембраны. Микроворсинки, расположенные в основании бластомеров, могут способствовать сближению соседних клеток при образовании морулы.
Интрацеллюлярные соединения и соединительные комплексы между бластомерами образуются в период дробления. Эти соединения устанавливают структуру бластоцисты и, возможно, определяют также специфическую позицию клеток во время дробления. Первичный контакт между клетками, видимо, обеспечивается микроворсинками, и, вероятно, этого достаточно для поддержания контакта в начальном периоде дробления. Соседние клетки соединены за счет интердигитаций микроворсинок, которые на этой стадии перераспределяются на эмбриональной поверхности. Микроворсинки сохраняются на наружной поверхности бластомеров и в базальной области контакта между соседними клетками, а в апикальной зоне контакта между клетками количество их становится ограниченным. Микроворсинки, сохраняющиеся в базальной зоне контакта, обеспечивая соединение соседних клеток, могут на большую глубину проникать в зону соседних клеток.
Фундаментальные изменения происходят во время компакции, когда в апикальной зоне контакта между соседними клетками образуются плотные соединения (десмосомы) и "гэп"-соединения (соединения "в виде ущелья"). Эти изменения начинаются более плотным соприкосновением мембран и уплотнением клеток в местах их начального слияния. Процессы эти кальций-зависимы. Фокусы тесного соприкосновения клеток, характеризующиеся к тому же плотным подлежащим материалом, предшествуют образованию десмосом вблизи наружной поверхности трофобластных клеток, при этом в апикальной области соседних клеток образуются соответствующие друг другу выступы и углубления.
Таким образом, наружная поверхность трофобласта образует значительный барьер проницаемости, ограничивающий свободное поступление различных веществ в зародыш, в то время как более базально расположенные соседние клетки разделяются ущельем шириной 4,0 нм и трофобласт проницаем для таких молекул как лантан. Во внутренних клетках эти изменения выражены не в такой значительной степени. Таким образом, компакция приводит к образованию в зародыше наружных и внутренних клеток, при этом внутренние клетки заключены в оболочку из наружных клеток, и это является первым указанием на то, что теперь в зародыше существует два типа клеток. Позднее наружные клетки образуют трофэктодерму бластоцисты и, возможно, внесут вклад и в некоторые другие закладки. Внутренние клетки, обнаруживаемые у мыши после восьмиклеточной стадии, дадут начало фетальньм компонентам.
Компакция включает в себя и другие значительные изменения в ультраструктуре слоя трофобластных клеток. В корковой зоне бластомеров происходит перераспределение клеточного скелета, выражающееся в том, что в точках контакта параллельно мембране располагается микротрубочки. Их функцией может быть стабилизация и укрепление мембраны. Образование микротрубочек является необходимым компонентом компакции. АТФ для покрытия энергетических потребностей трофобластных клеток поставляют, вероятно, митохондрии, перераспределяющиеся в корковую зону бластомеров. Кроме того, при образовании плотных соединений были обнаружены модификации мембран. Типичные решетки и полоски на поверхности внутренней мембраны (поверхность А) и соответствующие им бороздки наружной мембраны (поверхность В) были обнаружены в замороженных препаратах, "гэп"-соединения располагались базальнее плотных соединений. Трейсерные субстанции проникают в бластоцеле через трофобластные клетки и через "гэп"-соединения, но не через плотные соединения.
После появления десмосом на четырехклеточной стадии вклад в структуру зародыша постоянно повышается. В бластоцисте десмосомы между соседними клетками трофобласта очень сложны, связаны с микрофилламентами и поддерживают структуру зародыша. Они очерчивают будущую трофэктодерму, ткань, обладающую многими свойствами секреторного эпителия, электрическое сопротивление которой постоянно повышается. (Раздел по ультраструктуре зародыша написан по книге Edwards (34)).
Перейти к содержанию цикла статей: "Введение в медицину репродукции. Зачатие у человека."
Следующая глава - Физиология трубного транспорта зародыша
